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Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 3625 (2023) Citer cet article

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La recherche basée sur les biopuces évolue actuellement vers une base tridimensionnelle et à grande échelle similaire au microenvironnement in vivo. Pour l'imagerie en direct et à haute résolution à long terme de ces échantillons, la microscopie non linéaire capable d'imagerie sans étiquette et à plusieurs échelles devient de plus en plus importante. La combinaison avec l'imagerie de contraste non destructive sera utile pour localiser efficacement les régions d'intérêt (ROI) dans les grands spécimens et par conséquent minimiser les photodommages. Dans cette étude, une microscopie à cohérence optique photothermique sans étiquette (OCM) sert de nouvelle approche pour localiser le retour sur investissement souhaité dans les échantillons biologiques qui sont à l'étude par microscopie multiphotonique (MPM). La faible perturbation photothermique dans l'échantillon par le laser MPM à puissance réduite a été détectée au niveau des particules photothermiques endogènes dans la ROI à l'aide de l'OCM photothermique à différenciation de phase (PD – PT) très sensible. En surveillant le changement temporel du signal de réponse photothermique de l'OCM PD – PT, le point chaud généré dans l'échantillon focalisé par le laser MPM était situé sur la ROI. Combiné au mouvement automatisé de l'échantillon dans l'axe x-y, le plan focal du MPM pourrait être efficacement dirigé vers la partie souhaitée d'un échantillon volumétrique pour une imagerie MPM ciblée à haute résolution. Nous avons démontré la faisabilité de la méthode proposée en microscopie de génération de deuxième harmonique en utilisant deux échantillons fantômes et un échantillon biologique, un insecte fixe sur lame de microscope, avec des dimensions de 4 mm de large, 4 mm de long et 1 mm d'épaisseur.

La microscopie multiphotonique (MPM) permet des analyses à haute résolution dans divers domaines de recherche biologique. Ces dernières années, l'utilisation du MPM n'a cessé de gagner en attrait dans l'imagerie biomédicale, en particulier dans les domaines de l'imagerie neuronale profonde in vivo et vivante chez les petits animaux1,2,3,4,5, la détection précoce des tumeurs et sa caractérisation6,7, 8,9, réseau vasculaire et imagerie organoïde dans son microenvironnement dans des bio-puces10,11,12. Il y a eu de nombreuses approches pour augmenter la profondeur d'imagerie, un champ de vision plus large (FOV) et raccourcir le temps de balayage volumétrique en adoptant des fluorophores appropriés13, une optique adaptative14, des mécanismes multifaisceaux et multifocaux15,16, en plus d'autres modifications similaires. dans la configuration optique qui a donné des variations de systèmes d'imagerie MPM adoptables selon les besoins d'imagerie et les scénarios d'application 5,16,17,18,19,20,21.

Le photodommage et le photoblanchiment sont des facteurs critiques à prendre en compte dans l'imagerie multiphotonique. Un éclairage prolongé accompagné d'une puissance laser élevée nécessaire pour l'imagerie multiphotonique sans étiquette, il existe un photomécanisme de lésions tissulaires qui entraîne une fluorescence accrue provoquant la mort cellulaire, largement appelée photodommage 22,23,24. Pour éviter l'apparition de photodommages dans les cellules vivantes, il faut veiller à ce que les paramètres d'imagerie soient bien inférieurs au seuil de photodommage, comme l'intensité maximale, le taux de répétition et les temps d'exposition prolongés24. La plupart de ces paramètres peuvent être contrôlés par les systèmes de source et de détection. Plusieurs groupes de recherche ont étudié et proposé diverses approches pour supprimer les effets du photoblanchiment et des photodommages. La méthode la plus simple et la plus largement adoptée consiste à réduire la puissance d'éclairage totale d'une source lumineuse4,25,26. Cependant, cela réduit à son tour la sensibilité globale du système en raison du rapport signal sur bruit réduit. Les approches alternatives signalées pour atténuer cet effet impliquent une méthode d'exposition à la lumière contrôlée qui contrôle spatialement la lumière exposée sur l'échantillon, l'utilisation d'un séparateur d'impulsions passif qui redistribue l'impulsion laser d'éclairage en sous-impulsions d'énergies égales et un balayage optique rapide mécanisme qui réduit les photodommages en contrôlant l'éclairage et la collecte des émissions des spécimens27,28,29,30. De plus, en utilisant la méthode d'éclairage par nappe de lumière, seul le plan focal de l'objectif de détection est effectivement éclairé31. Bien que ces méthodes soient utiles pour réduire les effets de photodommage et de photoblanchiment, un éclairage à haute puissance à long terme est nécessaire lors de la recherche d'une région d'intérêt (ROI) dans de grands échantillons avec de petits FOV et de longs temps de balayage volumétrique, entraînant ainsi des photodommages et un photoblanchiment.

Au cours des dernières décennies, plusieurs groupes de recherche ont signalé les avantages d'incorporer à la fois le MPM et la tomographie par cohérence optique (OCT) en une seule plate-forme d'imagerie multimodale, où leurs avantages se compensent mutuellement les limitations des modalités32,33,34,35. En particulier, les techniques d'imagerie MPM et OCT ont des caractéristiques différentes en termes de résolution, de FOV, de profondeur d'imagerie et de vitesse d'imagerie. Par exemple, MPM utilise un mécanisme non linéaire qui nécessite un volume étroitement focalisé du faisceau laser dans l'échantillon avec un objectif à ouverture numérique élevée (NA) qui produit des résolutions latérales et axiales élevées mais un petit FOV. De plus, l'OCT est un système d'imagerie linéaire qui offre une flexibilité accrue dans le choix de la résolution et du FOV qui conviennent à votre application. En termes de profondeur d'imagerie, MPM fournit généralement des profondeurs d'imagerie de plusieurs centaines de micromètres dans des échantillons biologiques où il existe une diffusion et des aberrations élevées, tandis que l'OCT utilise le pouvoir de pénétration plus élevé des sources de lumière proche infrarouge pour atteindre des profondeurs d'imagerie de 1 à 2 mm dans des échantillons biologiques. . La génération d'images volumétriques d'échantillons à l'aide d'un système MPM nécessite l'utilisation d'une platine d'axe z avec un balayage bidimensionnel dans le sens transversal pour déplacer l'échantillon axialement. En revanche, l'OCT peut acquérir des images volumétriques en utilisant uniquement le balayage raster x-y sans déplacer l'échantillon axialement. Le système combiné MPM-OCT peut servir de plate-forme d'imagerie multi-échelle efficace pour les investigations biologiques par l'utilisation complémentaire de la supériorité de chaque système en imagerie.

Depuis l'introduction de l'OCT, divers groupes de recherche ont étudié et utilisé les différentes propriétés fonctionnelles de la source laser et du mécanisme de détection pour établir de nouvelles méthodes en ce qui concerne les exigences d'imagerie. Plusieurs exemples incluent l'OCT Doppler pour les mesures de débit dans les échantillons36, l'OCT sensible à la polarisation pour étudier les propriétés de biréfringence dans l'échantillon37,38, l'élastographie par cohérence optique pour mesurer la contrainte et la résistance à la traction des structures dans les échantillons37,38, l'OCT spectroscopique pour étudier la longueur d'onde dépendante absorption et diffusion de la lumière des structures dans les échantillons37,38 et OCT photothermique (PT-OCT) pour analyser les fluctuations thermiques dans les échantillons39,40,41. Parmi ces technologies, PT-OCT a attiré l'attention de la recherche pour l'évaluation des fluctuations thermiques des échantillons et les changements qui en résultent dans leurs propriétés physiques et optiques. Dans les systèmes PT-OCT, des nanoparticules, des agents de contraste exogènes sensibles à la photothermie et des absorbeurs ont été utilisés pour générer et mesurer les effets photothermiques dans l'échantillon42,43,44,45. À ce jour, les études utilisant des agents de contraste endogènes au lieu d'agents de contraste externes ont été limitées en raison du manque d'utilité et de la difficulté à mesurer de faibles signaux de réponse photothermique. Milner et al. ont proposé une mesure de phase différentielle pour la détection résolue en profondeur de la réponse photothermique dans les tissus, sans l'utilisation d'un contraste externe ou d'un matériau absorbant46,47. Bien que la technique de détection de réponse photothermique proposée puisse être appliquée à des échantillons sans avoir besoin de contraste ou d'absorbeurs, elle nécessite plusieurs canaux de détection dédiés et un retard optique de balayage rapide pour correspondre aux deux chemins interférométriques différents dans le balayage de l'échantillon introduit par le matériau biréfringent. De plus, la puissance laser d'éclairage requise est généralement de 80 à 100 mW pour les échantillons biologiques, afin de mesurer la réponse photothermique avec un rapport signal/bruit raisonnable47. Les progrès récents des techniques PT-OCT ont permis des mesures de réponse photothermique efficaces en utilisant un contraste endogène à l'aide d'un seul canal de détection et avec une puissance d'éclairage laser réduite de 4 à 10 mW39,48,49,50.

Cette étude sert de précurseur à la direction d'un nouveau mécanisme de localisation du retour sur investissement le long de trois axes dans le volume de l'échantillon pour réduire les effets globaux de photodommage et de photoblanchiment et améliorer la commodité de l'utilisateur dans l'imagerie multiphotonique d'échantillons volumétriques. Les retours sur investissement souhaités ont été sélectionnés dans la profondeur observable complète et la plage latérale de la microscopie à cohérence optique (OCM). Les modifications des propriétés optiques de l'échantillon dues aux effets photothermiques éclairés par la source laser MPM ont été mesurées au niveau des particules photothermiques endogènes dans la ROI à l'aide de l'OCM photothermique à différenciation de phase (PD – PT) très sensible. En surveillant le changement temporel du signal de réponse photothermique de l'OCM PD – PT, la position de mise au point du laser d'excitation (hotspot) a été placée sur la ROI. Combiné au mouvement automatisé de l'échantillon dans l'axe x-y, le plan focal du MPM pourrait être efficacement dirigé vers la partie souhaitée d'un échantillon volumétrique pour une imagerie MPM ciblée à haute résolution. La navigation ROI a été obtenue à l'aide d'une source laser MPM de faible puissance (inférieure à la puissance conventionnelle d'un facteur inférieur à 10). La méthode de guidage PD – PT OCM peut être mise en œuvre pour toute technique d'imagerie non linéaire nécessitant un éclairage laser de haute puissance, ce qui entraîne un photoblanchiment et des photodommages dans les échantillons, par exemple une fluorescence excitée à deux photons et une microscopie à diffusion Raman anti-Stokes cohérente.

Lorsqu'un faisceau laser à haute énergie irradie un échantillon, la température interne et les propriétés optiques de la structure interne de l'échantillon changent51. Dans la technique d'imagerie OCT, le signal d'interférence détecté dans le domaine de Fourier OCT peut être exprimé en Eq. (1) sous forme complexe :

où z est la différence de longueur de trajet entre le miroir de référence et l'interface dans l'échantillon. Le \({I}_{R}\) et le \({I}_{S}\) sont les intensités lumineuses rétroréfléchies du miroir de référence et de l'interface de l'échantillon, respectivement. Le \(\Phi \left(z,t\right)\) est le terme de phase du signal d'interférence, qui peut être représenté comme une fonction intégrale de l'indice de réfraction dépendant de la profondeur dans l'espace à un certain moment, comme exprimé par l'éq. (2):

où ω est la fréquence angulaire centrale de la source lumineuse et c est la vitesse de la lumière dans le vide. L'échantillon est supposé être situé du côté positif dans le domaine spatial, et \(n\left(z,t\right)\) représente la profondeur et l'indice de réfraction dépendant du temps dans l'échantillon. Lorsqu'un changement de température se produit dans l'échantillon, la réponse thermique observée optiquement dans l'échantillon est un changement de phase dû aux effets thermoélastiques et thermoréfractifs. Ainsi, l'éq. (2) peut être étendu compte tenu des réponses thermiques, telles qu'exprimées par l'Eq. (3) (Réf.47).

où dn/dT représente le changement de l'indice de réfraction avec la température, \(\Delta T\left(z,t\right)\) représente le changement de température dans les tissus de l'échantillon, et \(\beta\) est la dilatation thermique coefficient47. Pour mesurer les changements de phase dans l'échantillon dus à la réponse thermique lorsqu'il est éclairé par la source laser MPM, des signaux d'interférence complexes ont été obtenus sous forme de valeurs numérisées avec PD – PT OCM. Le terme de phase obtenu est la phase accumulée le long de la profondeur. Par conséquent, il faut d'abord différencier pour résoudre la phase accumulée46,47,49, comme exprimé par Eq. (4).

où \(m\) est l'indice de profondeur des A-scans, et \(n\) désigne les indices incrémentiels séquentiels désignés du premier au dernier signal A-scan avec un intervalle de temps \(\Delta t\). Le nombre total N de A-scans a été obtenu pour la même position latérale sur l'échantillon afin d'augmenter la sensibilité de la réponse thermique. Cela prend une période de temps de T qui est égale à \(\left(N-1\right)\) fois l'intervalle \(\Delta t\). Le N de A-scans est appelé une trame. Des A-scans successifs sont soustraits pour mesurer le changement de phase dans le temps, comme exprimé par l'Eq. (5).

où \(\varphi (m,n)\) est le bruit de phase aléatoire généré dans le système dans l'intervalle de temps \(\Delta t\) pour l'indice spatial × m et l'indice temporel n. Dans cette étude, 801 A-scans ont été obtenus pour la période de temps permettant d'obtenir 800 A-scans différenciés. Les phases différenciées au-delà de la plage de −π et π ont été enveloppées avec −2π pour éviter d'éventuelles erreurs près des limites –π et π. Une profondeur spécifique \(d\) d'intérêt a été sélectionnée parmi les profondeurs des A-scans, et 800 valeurs de phase différentielles à la profondeur ont été obtenues. d correspond au produit de \({m}_{s}\) et \(\Delta z\), où \({m}_{s}\) est l'indice de profondeur sélectionné et \(\Delta z\ ) est l'intervalle de profondeur. Nous avons fait la moyenne de ces valeurs de phase différentielles en une différence de phase effective qui s'est produite dans la période de temps pour supprimer les erreurs de phase aléatoires, améliorant ainsi la sensibilité de détection de la réponse thermique du système. Le bruit de phase résulte principalement des changements thermiques ambiants et des vibrations mécaniques dans le système. La phase différentielle moyenne \({\Delta \Phi }_{avg}(d)\) a ensuite été calculée à l'aide de l'équation. (6).

où \(\Delta ={\Delta }_{t}{\Delta }_{z}\) et \(\Delta \Phi ({m}_{s},n)\) désignent les valeurs de phase différentielle à une profondeur spécifique d dans le \({n}\)ème signal A-scan différencié, respectivement. Ce processus a été répété séquentiellement le nombre de fois souhaité \(Fn\) (numéro de trame). Ici, le terme cadre ne doit pas être confondu avec la désignation conventionnelle de B-scan, qui est généralement utilisée en imagerie OCT. Le \(Fn\) représente les 801 A-scans accumulés à partir d'un seul point. Le terme "trame" est utilisé ici pour que les lecteurs envisagent et corrèlent le sens du temps qu'il faut pour avoir un signal PD – PT-OCM lorsqu'ils peuvent se rapporter à un B-scan pour comprendre la capacité de mesure à grande vitesse du méthode proposée. Pour perturber la réponse photothermique dans l'échantillon et générer le changement de phase résultant avec la source laser MPM, un obturateur mécanique a été incorporé dans le trajet du faisceau d'éclairage MPM, puis a été contrôlé à distance pour s'ouvrir et se fermer à des moments spécifiés pendant la durée de \( Fn\), selon les conditions requises. Tout au long de cette étude, la valeur maximale utilisée pour \(Fn\) était de 50, sauf mention contraire. La mesure de 50 trames est appelée lecture de la réponse photothermique à la perturbation et correspond à un cycle d'éclairement. L'obturateur a été réglé pour s'ouvrir et se fermer près du centre de chaque cycle d'éclairage. Il s'agissait de s'assurer qu'il y avait suffisamment de temps pour que l'échantillon refroidisse à sa température naturelle. La mise en œuvre de l'action de l'obturateur pour une lecture unique de la réponse photothermique et du changement de phase typique dans le temps est illustrée à la Fig. 1.

Relation entre le nombre d'images, l'action de l'obturateur et la réponse photothermique pendant un cycle d'éclairage.

Les agents d'absorption endogène optique tels que les lipides, l'eau, la mélanine, l'hémoglobine, etc. sont largement présents dans les tissus biologiques52. Après avoir sélectionné une ROI dans l'image OCM volumétrique, un agent d'absorption dans la ROI qui présentait une réponse photothermique appropriée a été sélectionné comme point d'observation pour la réponse photothermique. Plus la position focale de la lumière d'excitation du MPM est proche du point d'observation, plus la réponse photothermique est grande. Nous avons mesuré plusieurs réponses photothermiques tout en faisant varier la distance entre le point d'observation et la position focale du faisceau d'éclairage, afin de déterminer le point auquel la réponse photothermique était maximisée. Il convient de noter que le plan focal de la lumière d'excitation MPM a été placé sur la ROI, et l'image MPM a pu être obtenue immédiatement sans se déplacer pour trouver la ROI. Une représentation schématique du flux de travail global susmentionné est illustrée à la Fig. 2. Combiné avec le mouvement automatisé de l'échantillon dans l'axe x-y, la recherche de localisation en profondeur du retour sur investissement a été étendue pour être explorée en trois dimensions.

Flux de travail pour la détection de la réponse photothermique avec l'OCM PD-PT sans étiquette. Description figurative étape par étape du processus impliqué dans le calcul du signal photothermique à l'aide de l'OCM PD – PT.

Deux échantillons fantômes différents ont été fabriqués et utilisés dans cette étude expérimentale pour démontrer et caractériser le MPM guidé par OCM PD – PT proposé. Le premier était un simple échantillon fantôme utilisé pour évaluer le concept et analyser le signal photothermique détecté. Un échantillon fantôme supplémentaire avec une structure multicouche a été utilisé pour valider la robustesse de l'applicabilité du système proposé à un échantillon complexe tel que le réseau de vaisseaux sanguins de structures tissulaires. Enfin, nous l'avons appliqué à un échantillon d'insecte (Ixodes dammini) de dimensions 4 × 4 × 1 mm, intégré dans une lame de microscope, pour évaluer l'applicabilité pratique du système pour des échantillons biologiques. Des informations détaillées sur les échantillons utilisés sont fournies dans la section "Matériels et méthodes".

Un échantillon fantôme simple (gel à ultrasons) a été utilisé pour caractériser et analyser la réponse photothermique en utilisant la méthode proposée. Le protocole expérimental était similaire pour toutes les expériences menées dans cette étude (se référer à la section "Matériels et méthodes" pour la fabrication d'échantillons fantômes de réseau simple et complexe et le protocole expérimental). La réponse photothermique a été mesurée comme illustré à la Fig. 3. Les particules de rétrodiffusion, telles que les bulles d'air ou la poussière, situées dans la région médiane du milieu de gel ont été sélectionnées dans l'image OCM en coupe comme point d'observation de la réponse photothermique. La position focale de l'objectif MPM a été déplacée vers le haut le long de l'axe optique de l'OCM, depuis le dessous de la lamelle et à travers la zone de gel ultrasonique de l'échantillon fantôme, comme illustré à la Fig. 3a. La réponse photothermique a été mesurée pour chaque mouvement de 10 µm de l'objectif MPM jusqu'à 500 µm de la distance de déplacement totale correspondant à 50 lectures. Le temps total requis pour 51 lectures était d'environ 73 s. Le temps passé à déplacer les traductions manuelles n'a pas été inclus. Comme le montre la figure 3b, le signal de réponse photothermique à des intervalles de 100 µm à partir des lectures totales est indiqué par la zone rectangulaire en pointillés. On peut voir que la réponse photothermique maximale détectée à chaque lecture présentait une augmentation et une diminution constantes à mesure que la position de mise au point de l'objectif MPM s'approchait et s'éloignait de la région médiane de l'échantillon, respectivement. Comme prévu, la réponse photothermique a été maximisée lorsqu'elle a traversé la région médiane du gel. Les figures 3c, d sont les graphiques agrandis illustrés à la figure 3b, qui indiquent les signaux de réponse photothermique observés lorsque le point focal de l'objectif MPM était proche du milieu de la région du gel et les caractéristiques détaillées de la réponse photothermique, respectivement. Comme on peut le voir tout au long de la Fig. 3b-d, la réponse photothermique détectée à toutes les lectures présentait deux pics représentant le changement de différence de phase correspondant à la perturbation de température maximale. La température dans l'échantillon a changé le plus rapidement juste après l'ouverture et la fermeture de l'obturateur. Lorsque l'obturateur était ouvert, le faisceau laser MPM était focalisé sur l'échantillon, induisant ainsi des effets photothermiques dus aux changements de la température interne de l'échantillon, qui était considérée comme la première région de perturbation de la température (augmentation de la température), comme le montre la Fig. 3c. Lorsque la température atteint son maximum et se stabilise, le changement de déphasage revient à une valeur proche de celle à la température de référence en l'absence d'éclairement. Lorsque l'obturateur s'est fermé, l'énergie thermique accumulée dans l'échantillon a commencé à diminuer. En d'autres termes, lorsque la cause de l'augmentation de température (faisceau laser MPM) n'est plus exposée à l'échantillon, la température globale de l'échantillon diminue et se stabilise à sa température naturelle initiale. Cela peut être considéré comme la deuxième région de perturbation de température (baisse de température), comme le montre la figure 3d.

Analyse du signal PD – PT OCM à l'aide d'un simple échantillon fantôme. (a) est la description figurative du mouvement de la position de mise au point du MPM sur une profondeur variée. (b) est la réponse photothermique complète observée dans l'échantillon fantôme simple dans une plage de profondeur de 500 µm. (c) est le graphique agrandi de la réponse photothermique observée dans la région médiane de l'échantillon. (d) est la réponse photothermique maximale observable dans l'échantillon. (e) est les valeurs de phase moyennes maximales tracées par rapport à la plage de profondeur de 500 µm dans l'échantillon. (f) est le graphique tracé à partir de la différence absolue entre les valeurs successives de (b). La figure (a) n'est pas dessinée à l'échelle.

Pour analyser plus en détail la quantité de la réponse photothermique en fonction du changement de la position focale de l'objectif, les valeurs maximales des signaux photothermiques sont tracées par rapport aux différentes positions focales de l'objectif MPM en profondeur, comme illustré à la Fig. 3e. Cela permet de visualiser la réponse thermique globale de l'échantillon. La ligne pointillée rouge sur la figure 3e indique le point d'observation sélectionné de l'OCM pour la réponse photothermique, étant donné que l'objectif MPM a été traduit sur toute la profondeur de l'échantillon. Les trois pics d'intensité (noir) sont les signaux SHG détectés correspondant à la première surface de la lamelle, la deuxième surface de la lamelle et la première surface de la lame de verre, respectivement. Le point d'observation de la réponse photothermique coïncide avec le milieu de la zone de gel entre les deux signaux SHG représentant la deuxième surface de la lamelle et la première surface de la lame de verre. En appliquant un ajustement polynomial de cinquième ordre (pour compenser le bruit de phase aléatoire induit) à la courbe du signal photothermique, une tendance de transition douce de la courbe a été obtenue. De plus, un graphique représentant la différence absolue entre les valeurs successives après ajustement polynomial est illustré à la Fig. 3f. Cela permet une visualisation claire de l'instance à laquelle le foyer de l'objectif MPM a coïncidé avec le point d'observation fixe.

Pour évaluer la sélection du retour sur investissement pour l'imagerie non linéaire à l'aide de PD – PT OCM, des échantillons fantômes composites multicouches de grande surface qui imitent la structure tissulaire des vaisseaux sanguins ou des réseaux neuronaux ont été utilisés dans l'expérience. L'échantillon contenait un tissu de nettoyage de lentille multicouche d'une épaisseur d'environ ~ 300 µm qui a été immergé dans de l'eau distillée (voir la section "Matériels et méthodes" pour plus de détails). Il est utilisé pour valider l'efficacité de la méthode de sélection du retour sur investissement en utilisant les capacités d'imagerie en coupe transversale et en face en temps réel de l'OCM, qui a un champ de vision plus large que le champ de vision limité du MPM. Ceci est illustré sur les figures 4a-c,e,f. La figure 4a présente l'image volumétrique tridimensionnelle (3D) OCM de l'échantillon avec un FOV de 3,0 × 3,5 × 0,3 mm le long des axes horizontal, vertical et de profondeur. L'image de volume 3D est mise en évidence par deux régions ROI rectangulaires : la ROI initiale (orange) et la ROI déplacée (bleu) aux emplacements souhaités pour l'imagerie MPM. La figure 4b,e présente les images OCM en face avec un champ de vision de 1,0 × 1,5 mm obtenu dans les régions ROI. Les figures 4c, f présentent des images agrandies des ROI présentées dans les zones rectangulaires bleues et jaunes de la figure 4b, e, respectivement, qui ont été utilisées pour la comparaison avec les images SHG. Le premier point d'observation dans la ROI initiale a été sélectionné à une profondeur de 100 μm, où il était proche de la lamelle. Le plan focal de l'objectif MPM a été positionné à l'aide du mécanisme de sélection ROI. Les figures 4e-g ont été obtenues après avoir déplacé l'échantillon à 1000 μm dans les directions latérales X et Y, respectivement, et à 100 μm dans le sens de la profondeur vers la lame de verre (axe Z); pour simuler la navigation de différentes ROI (se référer à la section "Matériels et méthodes" pour plus de détails). Avant le mouvement de l'échantillon, la région sélectionnée de la structure tissulaire pour l'imagerie MPM était proche de la lamelle ; et après le mouvement de l'échantillon, la région des structures tissulaires à imager a été déplacée plus près de la première surface de la lame de verre. La figure 4d, g présente les images MPM SHG obtenues avant et après le mouvement de l'échantillon. Les images SHG étaient des images empilées avec une plage de profondeur de 70 µm dans les boîtes rectangulaires orange et bleues représentées dans l'image volumétrique OCM, et cela est fait pour mieux correspondre et corréler les images MPM en face avec les images OCM en face. Les croix creuses dans les régions rouges, orange et bleues indiquées correspondent aux positions correspondantes dans les images respectives OCM et MPM en face.

Évaluation de la robustesse du MPM guidé par OCM PD – PT avec un échantillon fantôme de réseau complexe. (a) est l'image OCM volumétrique 3D de l'échantillon. (b, c, e, f) sont des images OCM en face de l'échantillon fantôme de réseau complexe. (c, f) sont les régions agrandies indiquées par des carrés en pointillés dans (b) et (e), respectivement. (d, g) sont les images empilées SHG en face du même emplacement numérisées en (c) et (f). De plus, en (a), les cases rectangulaires en orange et bleu indiquent la plage de profondeur d'empilement pour les images SHG aux ROI initiales et déplacées aux emplacements souhaités, respectivement.

Pour valider l'utilité du guidage PD – PT OCM pour les ROI dans un échantillon biologique de grand volume pour l'imagerie MPM, un spécimen biologique (femelle Ixodes dammini) intégré dans une lame de microscope a été utilisé. Avant l'imagerie photothermique, l'échantillon a été imagé avec le FOV maximal de l'OCM et post-traité à l'aide d'un logiciel de rendu de volume. Une image OCM 3D rendue en volume est illustrée à la Fig. 5a, et une image en face de l'image volumique à une profondeur de 65 µm est illustrée à la Fig. 5b. À l'aide des images OCM en coupe transversale et en face en temps réel, plusieurs sections différentes de l'échantillon biologique ont été ciblées à l'aide du mécanisme de sélection ROI basé sur la mesure de la réponse photothermique avec l'OCM PD – PT. Une surface totale de 4 × 4 mm (verticale × horizontale) est utilisée pour la sélection du retour sur investissement. En particulier, quatre régions ont été sélectionnées et ciblées, qui étaient situées sur la surface la plus élevée du Scutum/bouclier, le bord supérieur du palpe gauche, la pointe de l'hypostome et le bord supérieur du palpe droit. Parmi ces parties, l'hypostome, les bords gauche et droit des palpes ont été choisis car ces parties des tiques sont plus utiles dans les études sur les habitats d'alimentation des tiques liées à la maladie de Lyme53, et le scutum recouvre la partie supérieure de la surface dorsale. Presque toutes les parties du corps de l'échantillon offraient un bon signal PD – PT-OCM observable, et il convient de noter que la réponse du signal photothermique diminue avec une épaisseur plus élevée. Cela peut être dû à la composition et aux propriétés optiques et thermiques de l'échantillon. Les images SHG des régions ciblées sont présentées sur les figures 5c-f, respectivement. Les lectures totales des réponses photothermiques observées dans la région de l'hypostome en fonction des positions focales objectives du MPM variant en profondeur sont indiquées dans le graphique tracé à la Fig. 5g. L'intervalle de pas entre deux positions de profondeur utilisé ici est de 20 µm. Un total de 11 lectures ont été utilisées pour couvrir toute la région de l'hypostome. Comme on peut le voir sur le graphique d'une réponse photothermique représentative, comme le montre la figure 5h, les pics différenciés de phase maximum détectés n'étaient pas inversement proportionnels. Ceci peut être attribué à l'expansion thermoélastique des structures biologiques du spécimen.

Vérification de l'applicabilité du MPM guidé PD-PT OCM proposé pour un échantillon biologique. (a, b) sont l'image de rendu de volume OCM respective et l'image en face de l'échantillon d'insecte. Les figures (c à f) sont les images MPM en face de différentes régions de l'échantillon obtenues à l'aide du guidage PD – PT OCM. ( g ) est la réponse photothermique représentative observée en faisant varier la position en profondeur de l'objectif MPM dans la région de l'hypostome de l'échantillon, et ( h ) est le graphique représentatif d'un signal de réponse photothermique PD – PT OCM.

L'utilisation du MPM a progressivement gagné en popularité dans divers scénarios d'imagerie biomédicale. L'une de ces tractions où le MPM a gagné en applicabilité est la recherche basée sur les biopuces. La recherche basée sur les biopuces évolue actuellement des plateformes bidimensionnelles (2D) vers les plateformes 3D, similaires au microenvironnement in vivo. En particulier, il est nécessaire d'établir une complexité biologique à grande échelle pour créer des organes artificiels pour de futurs dépistages de drogues ou d'éventuels remplacements d'organes. Pour y parvenir, des recherches sont actuellement menées sur l'impression 3D et les méthodes d'auto-organisation basées sur les organoïdes54,55. Pour l'imagerie en direct à long terme et l'analyse multi-échelle des échantillons à grande échelle, la microscopie non linéaire capable d'imagerie des tissus profonds et d'imagerie sans étiquette devient de plus en plus importante56,57. Lors de la microscopie non linéaire, des précautions doivent être prises pour éviter les photodommages. La méthode proposée utilise des particules endogènes dans l'échantillon pour la localisation du retour sur investissement en 3D dans l'imagerie multiphotonique sans étiquette. La méthode proposée peut minimiser les photodommages en identifiant avec précision un retour sur investissement, où une imagerie moléculaire 3D haute résolution est requise (informations supplémentaires). Ce concept est similaire à celui de la microscopie à contraste de phase, qui est couramment utilisée dans les microscopes à fluorescence pour minimiser le photoblanchiment, mais ces mécanismes de guidage conventionnels n'offrent qu'une image topologique 2D de l'échantillon. L'OCT peut être utilisé comme modalité d'imagerie guidée de tissus biologiques à grande échelle, non transparents et épais en 3D, tout comme la microscopie à contraste de phase qui est utilisée comme outil d'imagerie de guidage pour les échantillons transparents.

Dans la présente étude, nous avons obtenu la courbe de réponse photothermique en changeant manuellement le point focal de l'objectif MPM qui est déplacé vers le point d'observation (objectif OCM). La courbe de réponse photothermique a la forme d'une fonction unimodale avec une valeur maximale dans la zone de mesure. À l'avenir, en incorporant une méthode de recherche efficace bien établie telle que la recherche de la section d'or58, la recherche de Fibonacci59 ou la recherche d'ajustement de courbe60 (avec un moteur de mise au point axial automatisé intégré à l'objectif) au lieu d'une recherche linéaire de 50 tentatives à des intervalles de 10 µm ; le point recherché peut être trouvé avec la même précision en moins de 10 tentatives. De plus, le temps de recherche peut être considérablement réduit lorsque l'algorithme de recherche à grande vitesse est combiné avec un dispositif motorisé à grande vitesse pour le balayage axial du plan focal de l'objectif MPM. Dans cette étude, ROI localisant dans un échantillon biologique relativement grand avec des dimensions de 4 × 4 mm (vertical × horizontal), un total de 11 lectures avec un intervalle de pas de 20 µm dans le sens de la profondeur a été utilisé. L'intervalle de pas et les lectures totales peuvent être choisis de manière adaptative en fonction de la composition et de l'épaisseur de l'échantillon.

La probabilité d'occurrence d'erreur pour l'emplacement de la ROI (en profondeur) pour le guidage objectif MPM dépend de la résolution axiale du système OCM et de la sensibilité de phase. La résolution axiale du système OCM utilisé est d'environ 5 µm. Par conséquent, la précision du guidage objectif du MPM est la même avec la résolution axiale de l'OCM. Le système d'imagerie multimodal proposé est configuré de manière à ce que l'OCM et le MPM soient alignés coaxialement et sur les côtés opposés de l'échantillon. La méthode démontrée mesure la position absolue du point chaud de l'objectif MPM dans l'échantillon, donc même si un échantillon avec des structures complexes et des interfaces d'échantillon est utilisé, la performance de la détection PD-PT-OCM n'est soumise à aucune mesure erronée. Le FOV du système PD-PT-OCM peut être modifié de manière adaptative selon les exigences d'imagerie en changeant les lentilles d'objectif dans l'échantillon et la configuration du bras de référence. Cependant, le FOV et la résolution latérale sont inversement liés. En général, les objectifs FOV plus larges auront une résolution latérale inférieure et vice versa. La capacité d'imagerie à résolution en profondeur de l'OCM est réduite dans les échantillons épais. Cela est dû aux limitations de la pénétration de la lumière dans les tissus épais. De plus, dans les échantillons épais avec des structures complexes densément emballées, les signaux générés multiphotoniques détectables diminuent dans les tissus plus profonds. Ainsi, la chaleur générée par le point chaud du MPM se dégradera également dans les tissus plus profonds. La facilité d'utilisation des méthodes proposées pour la sélection du retour sur investissement à l'aide de l'OCM n'est pas seulement limitée par l'épaisseur de l'échantillon fantôme rapportée ici. La sélection du retour sur investissement dans l'échantillon est possible sur toute la plage de profondeur optique de l'OCM et ne dépend que de la composition de l'échantillon et de l'optique utilisée pour le système OCM. Le signal photothermique généré dans l'échantillon peut être détecté efficacement sur toute la plage de profondeur observable du PD – PT-OCM. La dissipation du signal photothermique et la dégradation de l'efficacité de la détection dépendront de l'épaisseur de l'échantillon, de sa composition et de ses propriétés optiques et thermiques51.

Classiquement, l'imagerie OCT photothermique est utilisée pour imager les vaisseaux sanguins en utilisant l'effet photothermique des cellules sanguines, qui sont des substances endogènes, ou pour mesurer l'emplacement et les points chauds de particules photoréactives exogènes telles que les polymères et les nanotiges d'or dans les tissus vivants. L'OCM PD-PT hautement sensible peut également être utilisé si des facteurs endogènes ou exogènes sont présents dans la plage observable de l'image OCM. En utilisant la méthode proposée, nous pouvons cibler avec soin l'éclairage d'excitation pour la thérapie photothermique avec des substances exogènes et le restreindre localement à l'emplacement souhaité, évitant ainsi un chauffage inutile des tissus normaux.

En résumé, cet article sert de rapport préliminaire pour présenter la facilité d'utilisation potentielle de l'utilisation de PD-PT OCM comme outil de guidage pour la microscopie non linéaire pour naviguer efficacement et avec précision dans les ROI dans des échantillons de grand volume. Les ROI ont été sélectionnées en utilisant le grand FOV et la plage de profondeur observable dans les images OCM en face et en coupe transversale. Pour obtenir une imagerie MPM ciblée dans les ROI en 3D, des points chauds se produisant dans l'échantillon focalisé avec le laser MPM à faible puissance ont été détectés à l'aide de l'OCM PD – PT très sensible. Nous avons ensuite focalisé le laser MPM sur un point d'observation choisi parmi les agents d'absorption endogènes de la ROI. L'OCM PD-PT permet de placer la position focale de l'objectif MPM sur la ROI dans la plage de profondeur observable de l'image en coupe OCM. Trouver et cibler efficacement les retours sur investissement nécessitant une imagerie MPM haute résolution peut réduire le temps d'exposition global des lasers haute puissance, en particulier pour les grands échantillons, atténuant considérablement le photoblanchiment et les photodommages. Le système OCM PD – PT à haute sensibilité a des applications potentielles pour l'analyse de réaction photothermique car il peut détecter en temps réel même les changements de température dus à une faible perturbation photothermique se produisant dans des échantillons biologiques tridimensionnels. En outre, il convient de noter que l'utilité de la méthode de guidage basée sur l'OCM PD – PT proposée peut être mise en œuvre pour toute technique d'imagerie non linéaire nécessitant un éclairage laser de haute puissance (qui peut entraîner un photoblanchiment et des photodommages dans les échantillons) comme deux -fluorescence excitée par photons et microscopie à diffusion Raman anti-Stokes cohérente. Cela réduit le temps d'acquisition global requis pour l'emplacement du retour sur investissement dans les systèmes d'imagerie non linéaires.

La configuration globale du système d'imagerie multimodale est illustrée à la Fig. 6. La plate-forme d'imagerie multimodale avait deux sources lumineuses indépendantes. Le système OCM était alimenté par une source lumineuse à large bande superluminescente (SLD-37-HP3, Superlum Diodes Ltd., Carrigtwohill, Irlande) avec une puissance de sortie maximale de 18 mW centrée sur 840 nm. La sortie de la source était directement connectée au port d'entrée d'un circulateur optique (850-H7-L-15-FA, OF-LINK Communications Co., Ltd. Shenzhen Chine). Le port de sortie du circulateur était connecté à un collimateur doublet (F240APC-850, Thorlabs, Inc., NJ, USA) avec une taille de faisceau de 2,4 mm. Le faisceau collimaté a été balayé par trame le long des axes horizontal et vertical à l'aide d'un miroir de balayage de galvanomètre à deux axes (GVSM002-JP, Thorlabs, Inc., NJ, USA). Par la suite, le faisceau de balayage a été dirigé vers une combinaison de lentilles de balayage et de tube avec des longueurs focales de 54 mm (LSM04-BB, Thorlabs, Inc., NJ, USA) et 200 mm (TTL200-B, Thorlabs, Inc., NJ, États-Unis), respectivement. Avec cette configuration, la taille du faisceau optique (issu du collimateur) a été agrandie d'un facteur 3,7. Le faisceau élargi a ensuite été divisé par un séparateur de faisceau rectangulaire (BSW11, Thorlabs, Inc., NJ, USA) à un rapport de 50:50. Les faisceaux divisés ont été dirigés vers le bras de référence et la configuration du bras échantillon. Le faisceau vers le chemin de référence passait à travers une combinaison de systèmes optiques tels qu'un atténuateur variable continu (NDC-50C-4 M, Thorlabs, Inc., NJ, USA) et un objectif 4 × (UPlanFL N 4.0x, Olympus, Tokyo, Japon) avec une distance focale de 45 mm, suivi d'un miroir à large bande à haute réflexion (PF10-03-P01P, Thorlabs, Inc., NJ, USA). De même, dans le trajet de l'échantillon, le faisceau divisé incident était dirigé vers une lentille d'objectif qui correspondait aux spécifications de la lentille d'objectif utilisée dans le trajet de référence. Le faisceau laser rétroréfléchi de la surface de l'échantillon a interféré avec le faisceau de référence rétroréfléchi dans le séparateur de faisceau. Le signal d'interférence rétrodiffusé a été dirigé via un circulateur vers un spectromètre contenant une caméra à balayage linéaire (Sprint spl4096-140k, Basler AG, Ahrensburg, Allemagne) avec 4096 pixels. Dans la configuration actuelle, le spectre ne couvrait que la partie médiane du capteur de la caméra et seuls 2048 pixels de la caméra à balayage linéaire étaient utilisés. Les signaux détectés ont été traités sur un ordinateur pour afficher les images OCM en coupe et en face en temps réel. Le système OCM construit avait des résolutions axiale et latérale d'environ 5 µm et un champ de vision maximal de 4 × 4 × 1 mm le long des axes horizontal, vertical et de profondeur, respectivement. Un ensemble de 250 positions latérales (ligne A) a été scanné successivement pour construire une image OCM en coupe transversale 2D, et 250 positions horizontales ont été scannées (images 2D) pour obtenir un ensemble d'images en volume. Une profondeur spécifique a été sélectionnée dans l'ensemble d'images de volume (selon les besoins) pour obtenir une image de face en temps réel. Le système OCM avait une vitesse moyenne de 90 images par seconde.

Schéma du système d'imagerie multimodal. Schéma de conception optique avec les composants optiques utilisés avec les sources MPM et OCM, les composants de détection et la platine d'échantillon translationnelle micrométrique à deux axes. Figure non dessinée à l'échelle.

Le système MPM avait une source laser à fibre femtoseconde haute puissance (ELMO HP, Menlo Systems, Inc., NJ, USA) avec une puissance de sortie maximale de 180 mW et une largeur d'impulsion < 70 fs (typiquement 45 fs), et un taux de répétition de 100 MHz. La source laser était centrée à 1560 nm, avec une largeur de bande spectrale de 30 nm. Le faisceau laser a été collimaté à l'aide d'un collimateur triplet optique (TC18APC-1550, Thorlabs, Inc., NJ, USA) avec une taille de faisceau d'environ ~ 3 mm. La puissance du laser a été contrôlée selon les besoins à l'aide d'une combinaison d'atténuateurs optiques. Le faisceau se propageant est ensuite passé à travers un obturateur mécanique contrôlé électroniquement (SHB025, Thorlabs, Inc., NJ, USA). L'ordinateur a commandé l'obturateur mécanique pour obtenir un éclairage optique dans la région de l'échantillon pendant un temps de fonctionnement spécifique, selon les besoins. Le faisceau laser suivant après l'obturateur a été balayé par trame le long des axes horizontal et vertical à l'aide d'un miroir de balayage de galvanomètre à deux axes (GVSM002-JP, Thorlabs, Inc., NJ, USA). Le faisceau laser a ensuite été passé à travers une combinaison de lentilles de balayage (SL50-2P2, Thorlabs, Inc., NJ, USA) et de lentilles tubulaires (TTL200MP, Thorlabs, Inc., NJ, USA) avec des longueurs focales de 50 mm et 200 mm. , respectivement. Cette combinaison optique a amplifié le faisceau laser d'un facteur 4. Le faisceau laser collimaté et amplifié s'est propagé à travers un miroir dichroïque (FF801-Di02-25 × 36, IDEX Health & Science, LLC, New York, USA). Le miroir dichroïque a été placé à un angle d'inclinaison de 45° par rapport au faisceau laser incident. Le faisceau laser MPM redirigé a ensuite été focalisé sur l'échantillon à l'aide d'une lentille d'objectif asphérique 30 × (5723-CH 30x, Newport Corporation, CA, USA) avec une distance focale de 6,2 mm. Le faisceau laser MPM focalisé sur l'échantillon a généré les signaux SHG à partir de molécules d'échantillons, qui ont été rétrodiffusés et collectés par la lentille d'objectif. Les signaux SHG rétrodiffusés ont ensuite été transmis à travers le miroir dichroïque, qui a été dirigé vers une lentille tubulaire (TTL200MP, Thorlabs, Inc., NJ, USA) avec une distance focale de 200 mm, un filtre passe-bande (FF01-794/32-25, IDEX Health & Science, LLC, New York, USA) et lentille doublet achromatique (AC254-050-B, Thorlabs, Inc., NJ, USA) avec une distance focale de 50 mm. Ce faisceau a été transmis à un tube photomultiplicateur (H7422-50, Hamamatsu Photonics, Shizuoka, Japon). Les signaux convertis électriquement ont été préamplifiés puis transmis à un ordinateur pour un traitement ultérieur, afin d'obtenir les images MPM SHG en face de l'échantillon. Le système MPM avait une résolution d'environ ~ 1 µm. Avec la configuration optique indiquée, un FOV maximum de 300 × 300 µm a été atteint.

Les systèmes d'imagerie OCM et MPM ont été montés sur un microscope (OLYMPUS-IX73, Olympus, Tokyo, Japon) à partir des directions supérieure et inférieure, respectivement, et les faisceaux laser OCM et MPM ont été alignés coaxialement. Les coordonnées x et y du ROI pour le MPM haute résolution ont été sélectionnées à partir de l'image OCM en temps réel en face. Nous avons sélectionné la coordonnée de profondeur du retour sur investissement à partir de l'image OCM en coupe transversale corrélée, qui était la position de profondeur pour observer la réponse photothermique. Le ciblage latéral du retour sur investissement sélectionné pour le MPM a été mis en œuvre par le mouvement de translation d'une étape de micro-positionnement (X et Y) (MCL-MOTNZ, Mad City Labs Inc., WI, USA). La lumière d'excitation du MPM a ensuite été focalisée sur la position en profondeur du retour sur investissement en observant les changements dans la réponse photothermique tout en modifiant la position focale du MPM par rapport au mouvement axial intégré du corps du microscope. Le mouvement de translation de l'échantillon a été automatisé à l'aide du programme LabVIEW, tandis que le mouvement axial a été contrôlé manuellement.

Pour évaluer et analyser la méthodologie et la robustesse du système d'imagerie MPM guidé multimodal PD – PT proposé, deux échantillons fantômes ont été fabriqués. L'un des échantillons a été préparé en plaçant un gel à ultrasons disponible dans le commerce sur une lame de verre de 1 mm, et une lamelle de 170 ± 5 µm d'épaisseur a été empilée sur le gel à ultrasons, comme illustré à la Fig. 7a. Ici, le gel ultrasonique est utilisé car ses propriétés thermiques sont plus stables et sa conductivité thermique est proche des tissus biologiques61. L'épaisseur globale de l'échantillon fabriqué était d'environ 1500 µm et l'épaisseur du gel à ultrasons introduit était d'environ 330 µm. De même, nous avons développé un échantillon fantôme de réseau complexe multicouche pour imiter les structures de réseau complexes dans les tissus biologiques, comme le montre la figure 7b. Des tissus de lentilles multicouches d'une épaisseur globale d'environ 300 µm et de l'eau distillée ont été utilisés à la place du gel à ultrasons, et l'épaisseur totale de l'échantillon était d'environ 1470 µm. Un époxy à prise rapide a été utilisé pour sceller la zone entourant la lamelle dans les deux échantillons afin d'empêcher l'évaporation de l'eau. L'échantillon a été monté avec une lamelle orientée vers l'objectif MPM, tandis que la lame de verre était orientée vers l'OCM, comme indiqué sur les Fig. 7a, b. Pour démontrer l'utilité du guidage PD-PT OCM pour les ROI dans un échantillon biologique de grand volume pour l'imagerie MPM, un échantillon biologique (Ixodes dammini (Deer Tick) Female, wm Microscope Slide, Carolina Biological Supply, NC, USA) intégré dans un une lame de microscope a été utilisée qui mesurait 3 mm de longueur et de largeur (à l'exclusion de certaines parties des pattes). Pour obtenir les réponses photothermiques PD – PT OCM des échantillons fantômes et de l'échantillon biologique, la position de mise au point initiale de l'objectif MPM a été placée à 30 µm sous la lamelle, et la lentille d'objectif MPM a été déplacée axialement vers l'échantillon par incréments de 10 µm d'intervalle. , comme le montre la figure 7c. À chaque mouvement de l'objectif MPM, l'obturateur mécanique était réglé pour s'ouvrir pendant la période de temps souhaitée (350 ms, sauf indication contraire) pour chaque acquisition de signal PD – PT OCM. Les points d'observation de l'OCM, où les réponses photothermiques ont été mesurées, ont été sélectionnés parmi les points de la ROI qui ont fourni le signal photothermique approprié. Principalement, l'intervalle de pas spécifié ici n'est pas une valeur absolue qui doit être strictement respectée. Par exemple, un intervalle de pas de 20 µm a été utilisé pour générer la réponse photothermique de l'échantillon biologique (femelle Ixodes dammini) illustré à la Fig. 5. L'intervalle de pas et les lectures totales peuvent être sélectionnés de manière adaptative en fonction de la composition et de l'épaisseur de l'échantillon.

Schéma des échantillons fantômes et du protocole expérimental PD – PT OCM. (a) est la représentation schématique en coupe transversale de l'échantillon fantôme simple fabriqué avec un gel à ultrasons. (b) est une représentation schématique en coupe transversale de l'échantillon fantôme de réseau complexe fabriqué avec du tissu de lentille multicouche. c est la représentation figurative du positionnement objectif MPM pour la méthodologie basée sur PD – PT OCM. Figures non dessinées à l'échelle.

Toutes les données nécessaires requises pour analyser et reproduire les résultats et les conclusions présentés dans le manuscrit sont fournies dans les sections pertinentes du manuscrit. Des détails et des données supplémentaires liés à cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Ce travail a été soutenu par le Korea Basic Science Institute [numéro de subvention D300300 et C330210] et l'Institut de planification et d'évaluation des technologies de l'information et des communications (IITP) financé par le gouvernement coréen (MSIT) [No. 1711152793].

Center for Scientific Instrumentation, Korea Basic Science Institute, 169-148 Gwahak-ro Yuseong-gu, Daejeon, 34133, République de Corée

Naresh Kumar Ravichandran, Hwan Hur, Hyemi Kim, Sangwon Hyun, Ji Yong Bae, Dong Uk Kim, I Jong Kim, Ki-Hwan Nam, Ki Soo Chang et Kye-Sung Lee

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KSL a développé le concept de design et co-développé le système d'imagerie. RNK a co-développé le système, réalisé des expériences et traité des données. RNK a rédigé le brouillon du manuscrit. KSL et KSC ont révisé de manière critique le manuscrit. HK a fabriqué l'échantillon de biopuce utilisé dans les informations supplémentaires. Tous les auteurs ont participé aux discussions et ont contribué à la rédaction et à la révision du manuscrit.

Correspondance à Ki Soo Chang ou Kye-Sung Lee.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Ravichandran, NK, Hur, H., Kim, H. et al. Microscopie à cohérence optique photothermique sans étiquette pour localiser les régions d'intérêt souhaitées dans l'imagerie multiphotonique d'échantillons volumétriques. Sci Rep 13, 3625 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30524-z

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Reçu : 27 octobre 2022

Accepté : 24 février 2023

Publié: 03 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-30524-z

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