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Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 263 (2023) Citer cet article

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La fermeture du tube neural (NTC) est un processus complexe de développement embryonnaire impliquant des mécanismes moléculaires, cellulaires et biomécaniques. Alors que les facteurs génétiques et la signalisation biochimique ont été largement étudiés, le rôle de la biomécanique tissulaire reste pour la plupart inexploré en raison du manque d'outils. Ici, nous avons développé une modalité optique qui peut effectuer une imagerie mécanique en accéléré du tissu de la plaque neurale lorsque l'embryon subit une neurulation. Cette technique est basée sur la combinaison d'un microscope confocal Brillouin et d'une culture ex ovo modifiée d'embryon de poulet avec un incubateur sur scène. Avec cette technique, pour la première fois, nous avons capturé l'évolution mécanique du tissu de la plaque neurale avec des embryons vivants. Plus précisément, nous avons observé l'augmentation continue du module tissulaire de la plaque neurale pendant le NTC pour les embryons cultivés ex ovo, ce qui est cohérent avec les données de la culture in ovo ainsi que les études précédentes. Au-delà de cela, nous avons constaté que l'augmentation du module tissulaire était fortement corrélée à l'épaississement et à la flexion des tissus. Nous prévoyons que cette technique sans contact et sans étiquette ouvre de nouvelles opportunités pour comprendre les mécanismes biomécaniques du développement embryonnaire.

La fermeture du tube neural (NTC) est une procédure centrale de neurulation des vertébrés où la plaque neurale plane sera élevée et fusionnée pour former un tube neural creux. Un échec de cette procédure peut entraîner de graves malformations du tube neural, qui représentent l'une des malformations congénitales humaines les plus courantes1. Les processus génétiques et moléculaires qui guident les NTC ont été largement étudiés pendant de nombreuses décennies2,3,4. D'autre part, les mécanismes biomécaniques qui peuvent être impliqués dans les NTC attirent de plus en plus l'attention ces dernières années5,6,7. Aux niveaux cellulaire et tissulaire, la morphogenèse du tube neural peut être considérée comme le résultat de l'interaction entre la force générée et la résistance mécanique du tissu embryonnaire8,9 : la fermeture réussie du tube neural nécessite que la force intrinsèque puisse surmonter la tension des tissus opposés qui repose sur sa propriété élastique. Ainsi, l'altération de la biomécanique tissulaire peut entraîner un défaut de fermeture et donc une malformation du tube neural10. Bien que la production de force et le changement mécanique des tissus au cours de la procédure de NTC aient été observés dans des expériences10,11,12, la contribution quantitative de processus biomécaniques spécifiques pour assurer une neurulation robuste reste pour la plupart inconnue. L'une des principales raisons est le manque d'outils capables de cartographier la biomécanique du tissu de la plaque neurale in situ et en temps réel lorsque l'embryon se développe.

De nombreuses techniques importantes ont été développées pour quantifier les propriétés mécaniques du tissu embryonnaire13, qui peuvent être approximativement classées en trois catégories : (1) les techniques basées sur le contact, y compris la microscopie à force atomique (AFM)14,15 ou les indentations basées sur le microcantilever11,16,17 pour mesurer le module de Young apparent à l'échelle nm à µm, l'aspiration à la micropipette pour mesurer la tension des tissus à l'échelle µm18 et le test de traction des tissus à l'échelle ~ mm19. Alors que les techniques basées sur le contact peuvent fournir une quantification directe des propriétés viscoélastiques du tissu dans des conditions quasi statiques ou à basse fréquence, elles nécessitent un accès physique à l'échantillon et doivent appliquer une force pour déformer l'échantillon pendant la mesure. Étant donné que le tissu du tube neural a une forme irrégulière en 3D et est mécaniquement interconnecté, des explants isolés sont généralement nécessaires pour des tests mécaniques sans ambiguïté. (2) Capteurs à base de perles/gouttelettes, y compris les pincettes optiques/magnétiques20,21 et les microgouttelettes22. La pince à épiler optique/magnétique utilise des billes rigides entraînées par la force (~ µm de diamètre) pour détecter les propriétés rhéologiques des tissus localisés, et la microgouttelette utilise des gouttelettes déformables (4 à 80 µm de diamètre) pour quantifier le stress tissulaire. Ces capteurs peuvent mesurer quantitativement les propriétés mécaniques avec une résolution subcellulaire ou cellulaire après un étalonnage minutieux. Cependant, ils nécessitent l'injection de billes ou de gouttelettes dans les tissus, ce qui les rend invasifs et à faible débit. (3) Ablation/dissection des tissus. Cette méthode utilise soit un faisceau laser pulsé ultrarapide10 soit une lame23 pour disséquer une partie du tissu et évaluer la tension tissulaire en fonction de la réponse de relaxation. Il s'agit d'une technique attrayante en raison de la configuration simple. Cependant, en raison de la connexion mécanique du tissu embryonnaire en 3D, cette méthode fournit principalement une évaluation globale à une échelle relativement grande (~ 100 µm à ~ taille mm). Pour résumer, les méthodes existantes peuvent quantifier divers aspects des propriétés mécaniques des cellules et des tissus avec différentes échelles spatiales et temporelles et ont considérablement fait progresser l'évaluation de la biomécanique des tissus embryonnaires. Cependant, en raison des limitations techniques, la cartographie mécanique in situ du tissu de la plaque neurale au cours de la procédure de NTC dans les embryons vivants n'a pas été rapportée.

La microscopie confocale Brillouin est une technique émergente pour quantifier les propriétés mécaniques des matériaux biologiques24,25,26. Différente des méthodes d'essais mécaniques conventionnelles, la microscopie Brillouin utilise un faisceau laser pour mesurer les propriétés élastiques du matériau. Ceci est basé sur un phénomène optique appelé diffusion spontanée de la lumière Brillouin27, où l'interaction du faisceau laser incident et du phonon acoustique inhérent dans le matériau introduira un décalage de fréquence (c'est-à-dire un décalage Brillouin) à la lumière diffusée (voir "Méthodes") . En mesurant le décalage Brillouin de la lumière diffusée à l'aide d'un spectromètre personnalisé, le module élastique longitudinal du matériau peut être directement quantifié. Étant donné que le microscope Brillouin est conçu dans une configuration confocale, il peut atteindre une résolution spatiale limitée par la diffraction. Au cours des dernières années, nous avons innové cette technique et démontré sa faisabilité pour quantifier les propriétés mécaniques d'une seule cellule28,29, du tissu embryonnaire30 et de la plaque neurale31 avec une résolution subcellulaire et une sensibilité mécanique suffisante. En tant que technique entièrement optique, le microscope Brillouin peut mesurer la biomécanique de manière sans contact, non invasive et sans étiquette. Par conséquent, cela pourrait être un outil prometteur pour cartographier les propriétés élastiques du tissu de la plaque neurale in situ au cours du développement embryonnaire.

Dans ce travail, nous avons développé une modalité optique qui peut effectuer une imagerie mécanique accélérée de NTC dans l'embryon de poulet. Pour ce faire, nous avons intégré un microscope confocal Brillouin avec un incubateur sur scène pour la culture ex ovo modifiée. La culture ex ovo garantit que l'embryon se développe en continu sur 21 h, couvrant l'ensemble des événements de NTC. Par rapport à la culture in ovo où l'embryon se développe à l'intérieur d'une coquille d'œuf opaque, la culture ex ovo offre une accessibilité optique supérieure et permet ainsi une imagerie en champ clair et Brillouin en temps réel pendant le développement de l'embryon. Nous avons ensuite utilisé la microscopie Brillouin pour acquérir en continu des images mécaniques 2D du tissu de la plaque neurale crânienne au fur et à mesure que l'embryon subissait une neurulation. Avec cette modalité, nous avons observé une nette augmentation du décalage de Brillouin moyen du tissu de la plaque neurale pendant le NTC de l'embryon de poulet cultivé ex ovo, ce qui est cohérent avec les résultats du système de culture in ovo. Fait important, nous avons constaté que l'augmentation du module tissulaire sur l'axe dorsal-ventral était fortement corrélée à l'épaississement de la plaque neurale ainsi qu'à l'angle de fermeture, indiquant que la mécanique tissulaire peut être synchronisée avec le changement géométrique de la plaque neurale pour obtenir un fermeture réussie du tube neural. Ensemble, cette modalité d'imagerie mécanique time-lapse peut fournir de nouvelles données pour comprendre les mécanismes biomécaniques au cours de la neurulation embryonnaire.

L'imagerie mécanique 2D time-lapse a été réalisée sur un microscope Brillouin inversé (Fig. 1a) (voir "Méthodes"). Par définition, le décalage de Brillouin est positivement lié au module longitudinal par les propriétés du matériau, notamment l'indice de réfraction \(n\) et la densité \(\rho\). Pour les matériaux biologiques, le rapport de l'indice de réfraction et de la densité \(\rho /{n}^{2}\) s'avère approximativement constant au cours des processus physiologiques24,32. Par conséquent, nous avons utilisé ici le décalage de Brillouin pour interpréter le changement relatif du module longitudinal. Dans la culture ex ovo modifiée, l'embryon a été placé dans une boîte de Pétri avec la face dorsale vers le bas (Fig. 1b). La boîte a ensuite été placée dans l'incubateur sur scène pour soutenir le développement de l'embryon (> 21 h). Les images en champ clair accélérées suggèrent que les embryons de la culture ex ovo se sont développés avec un rythme similaire à celui de la culture in ovo (Figs supplémentaires S1 – S2).

Schéma de l'installation. (a) Microscope confocal Brillouin avec incubateur sur scène. Lame quart d'onde QWP, séparateur de faisceau polarisé PBS, coupleur fibre FC. (b) Boîte de transport pour la culture ex ovo. La vue latérale (en haut) et la vue de dessus (en bas) affichent tous les composants, y compris l'embryon dans le support.

Pour exclure tout impact potentiel de la culture ex ovo et de l'illumination laser sur la mécanique tissulaire de la plaque neurale, nous avons collecté des embryons cultivés in ovo (N = 46) à différents stades de Hamburger Hamilton (HH) (HH 6 à HH 12) et acquis des images mécaniques 2D de la coupe transversale perpendiculaire à l'axe antéro-postérieur (près de la région crânienne). Les images représentatives de Brillouin suggèrent que la plaque neurale de l'embryon aux stades HH ultérieurs présente un décalage de Brillouin plus élevé que les stades antérieurs (Fig. 2a – d). Nous avons ensuite quantifié le décalage Brillouin moyen de la région de la plaque neurale à un emplacement similaire de l'axe antérieur-postérieur pour tous les embryons collectés. Nous avons observé que le décalage de Brillouin de la plaque neurale montrait une nette augmentation de HH 6 à HH 9 + et maintenait approximativement sa valeur par la suite (Fig. 2e). La plaque neurale de l'embryon au dernier stade (c'est-à-dire HH 12) a un décalage Brillouin moyen de 6,353 GHz, soit 0,126 GHz de plus que celui des embryons au stade précoce (c'est-à-dire HH 6), correspondant à une augmentation d'environ 60% du module selon la relation empirique entre module longitudinal et module de Young obtenu à partir de cellules28 (voir "Méthodes").

Résultats d'embryons cultivés in ovo. ( a - d ) Images représentatives de Brillouin du tissu du tube neural crânien de quatre embryons à différents stades HH: ( a ) HH 6, ( b ) HH 8, ( c ) HH 11, ( d ) HH 12. La ligne pointillée rouge décrit le région de la plaque neurale. ( e ) Les déplacements moyens de Brillouin de la plaque neurale crânienne des embryons révèlent une augmentation continue du module tissulaire par rapport au stade de développement. Nombre d'embryons : 46. Chaque point représente le décalage Brillouin moyen d'un embryon. La barre d'échelle est de 50 µm.

Pour capturer l'évolution mécanique de la plaque neurale pendant toute la procédure de NTC, nous avons effectué une cartographie mécanique en accéléré d'embryons cultivés ex ovo. L'embryon a été cultivé en continu pendant plus de 14 h (Fig. S3 supplémentaire), au cours de laquelle l'image de Brillouin en accéléré de la coupe transversale de la plaque neurale a été acquise au niveau du cerveau postérieur / région cervicale (Fig. 3a) à la troisième paire de somites le long de la plaque neurale en développement (Fig. S3 supplémentaire). Les résultats montrent que le décalage Brillouin moyen de la plaque neurale augmente continuellement avec le temps de culture (Fig. 3b), ce qui est cohérent avec le résultat des embryons cultivés in ovo. Des expériences répétées (N = 9) suggèrent que l'augmentation du déplacement de Brillouin de la plaque neurale pendant le NTC est un phénomène courant pour les embryons de poulet (Fig. 3d). Plus précisément, le décalage de Brillouin de la plaque neurale a augmenté de manière significative de HH 8- à HH 9 et a subi des modifications mineures par la suite. Au point final de la culture ex ovo (HH 10), les plaques neurales ont un décalage Brillouin moyen de 6,336 GHz, soit 0,097 GHz supérieur à celui du stade le plus précoce (HH 8-), correspondant à l'augmentation relative de ~ 46% en termes de module de Young. Ceci est cohérent avec le résultat des embryons cultivés in ovo, confirmant que la culture ex ovo et l'éclairage au laser n'ont pas affecté l'évolution mécanique du tissu de la plaque neurale au cours du développement embryonnaire.

Imagerie Time-lapse Brillouin d'embryons en culture ex ovo. ( a ) Images Time-lapse Brillouin d'un embryon représentatif pendant 14 h. (b) Le décalage Brillouin moyen du tissu de la plaque neurale de l'embryon en (a) augmente avec le temps de culture. (c) L'épaisseur du tissu de la plaque neurale de l'embryon en (a) augmente avec le temps de culture. ( d ) Une augmentation du décalage de Brillouin par rapport au stade de développement est observée pour tous les embryons (N = 9). (e) Un épaississement des tissus par rapport au stade de développement est observé pour tous les embryons. ( f ) Corrélation entre le décalage Brillouin moyen et l'épaisseur du tissu de la plaque neurale. Les symboles représentent différents embryons. Nombre de mesures : 39. Le test t à deux échantillons est utilisé pour quantifier la signification statistique. *p = 0,008 ; **p = 0,012 ; ***p = 0,049 ; ****p = 0,01. La barre d'échelle est de 50 µm.

En utilisant la mécanique tissulaire comme mécanisme de contraste dans l'imagerie Brillouin, nous pouvons également quantifier les changements morphologiques de la plaque neurale au cours du NTC. Ici, nous avons mesuré l'épaisseur moyenne des deux sites qui est au milieu de la distance entre le point charnière médian et les pointes neurales (Fig. 3c). Conformément à la littérature publiée2,33, nous avons observé un épaississement quadruple de la plaque neurale de HH 8- (~ 13 µm) à HH 9 (~ 52 µm) (Fig. 3e). Curieusement, nous avons constaté que l'épaississement des tissus et l'augmentation du module tissulaire présentent des tendances très similaires au cours de la procédure de NTC. Nous avons ensuite tracé le décalage de Brillouin en fonction de l'épaisseur pour tous les embryons cultivés ex ovo et avons trouvé une forte corrélation (\(p<1\times {10}^{-6}\)) entre l'augmentation du décalage de Brillouin et l'épaississement des tissus (Fig. 3f). Ces données suggèrent que l'augmentation du module longitudinal des tissus et l'épaississement des tissus sont probablement des événements temporellement coordonnés au cours du NTC.

Le NTC est un processus biomécanique complexe de mise en forme et de structuration des tissus qui est entraîné par la force et les propriétés mécaniques du tissu. Par conséquent, il est fondamentalement nécessaire de comprendre la relation entre la mécanique des tissus et la géométrie. Ici, nous avons observé empiriquement comment l'augmentation du module tissulaire est coordonnée au changement géométrique de la plaque neurale. Selon les images de Brillouin, nous avons défini l'angle de fermeture \(\beta\) comme l'intersection des côtés gauche et droit de la plaque neurale au point charnière médian (Fig. 4a). Sur la base de la définition, \(\beta =180^\circ\) et 0° représentent la plaque neurale est plate et complètement fermée, respectivement. Ensuite, nous avons distribué des embryons cultivés ex ovo (stades de développement entre HH8 et HH10) dans chaque intervalle de 10º et calculé les valeurs moyennes pour tout intervalle ayant plusieurs embryons. Nous avons ensuite tracé le décalage de Brillouin \({\omega }_{B}\) par rapport à l'angle de fermeture \(\beta\) (Fig. 4b). Les données peuvent être bien ajustées par une simple courbe empirique \({\omega }_{B}=A\cdot \mathrm{exp}\left(B\cdot \beta \right)+C\), avec des paramètres ajustés \ (A=-0,024, B=7,85\times {10}^{-3},\) \(C=6,348\) et le coefficient d'ajustement \({R}^{2}=0,67\). Cette corrélation positive suggère que l'augmentation du module tissulaire est probablement synchronisée avec la flexion de la plaque neurale au cours de la procédure de NTC. Notez que cette analyse n'a pas pris en compte les embryons antérieurs à HH 8- ou postérieurs à HH 10, stades auxquels la mécanique tissulaire peut être différente pour le même angle de fermeture (180° ou 0°). Puisque le microscope Brillouin a une configuration confocale, l'angle de diffusion ne sera pas affecté par la flexion de la plaque neurale ; ainsi, nous avons exclu les artefacts potentiels introduits par la flexion des tissus dans l'augmentation observée du décalage de Brillouin. Une enquête plus approfondie est nécessaire pour comprendre le mécanisme biologique sous-jacent qui coordonne l'augmentation du module tissulaire et de la flexion.

L'augmentation du décalage Brillouin est corrélée à la flexion des tissus pour les embryons cultivés ex ovo. (a) Définition de l'angle de fermeture. (b) L'angle de fermeture est corrélé au déplacement moyen de Brillouin de la plaque neurale. Les données des embryons aux stades de développement de HH 8 à HH 10 sont collectées. \(\beta =180^\circ\) et 0° représentent la plaque neurale est plate et complètement fermée, respectivement. Les embryons sont répartis dans chaque intervalle de 10° en fonction de l'angle de fermeture. Le point de données représente la valeur moyenne des embryons dans le même intervalle. La barre d'erreur représente l'écart type. La courbe pleine correspond au résultat d'une fonction empirique.

Ici, nous avons développé une modalité optique pour la cartographie mécanique time-lapse d'embryons de poulet vivants. Cette modalité est basée sur la combinaison d'un microscope confocal Brillouin et d'un système de culture ex ovo modifié, qui a une résolution subcellulaire et une sensibilité mécanique suffisante. Différente des techniques conventionnelles de test mécanique, notre méthode utilise un faisceau laser focalisé pour quantifier la mécanique des tissus, ce qui la rend sans contact, non invasive et sans étiquette. Nous avons confirmé que la culture ex ovo et l'illumination laser n'ont pas perturbé le développement de l'embryon. Nous avons démontré la faisabilité de cette technique en acquérant des images mécaniques 2D de la plaque neurale in situ lorsque l'embryon a subi une neurulation. Nous avons constaté que le tissu de la plaque neurale a connu une augmentation continue du module tissulaire pendant le NTC. Un raidissement des tissus pendant la neurulation a déjà été signalé chez d'autres espèces. Par exemple, le module d'élasticité du neuroépithélium des embryons d'axolotl a augmenté d'un facteur du stade 13 au stade 1519. De plus, il a été observé que le tissu neural dorsal de l'embryon précoce de Xenopus augmentait de près de 4 fois du stade 11,5 au stade 2111. Récemment , les études préliminaires sur l'embryon de souris suggèrent une augmentation de 80 % du module tissulaire lors de la neurulation par microscopie Brillouin31,34. Bien que ces données ne soient pas directement comparables à ce travail en raison des différences d'espèces et/ou des techniques utilisées, la tendance similaire observée dans les embryons de poulet suggère que la biomécanique des tissus peut jouer un rôle important au cours du NTC entre les espèces. L'augmentation du module tissulaire est probablement causée par l'augmentation de la densité cellulaire et/ou l'accumulation de la contractilité de l'actomyosine10,11,15, qui devrait être étudiée dans les travaux futurs. Au-delà de cela, nous avons observé que l'augmentation du module tissulaire est fortement corrélée à l'épaississement et à la flexion des tissus.

La neurulation est un processus complexe impliquant des activités cellulaires, moléculaires et biomécaniques9,36. Alors que la régulation génétique et la signalisation biochimique ont été largement étudiées, le mécanisme biomécanique est moins exploré et le lien sous-jacent entre les activités cellulaires/moléculaires microscopiques et la morphogenèse macroscopique est pour la plupart inconnu5. Étant donné que notre technique tout optique peut quantifier directement la mécanique tissulaire 2D/3D dans des embryons vivants intacts, elle peut potentiellement ouvrir de nouvelles opportunités pour mieux comprendre le rôle des mécanismes biomécaniques dans la procédure de NTC. Par exemple, quelques activités cellulaires cruciales, notamment l'extension convergente37, la constriction apicale38 et la migration nucléaire intercinétique39,40, peuvent coordonner ensemble l'augmentation observée du déplacement, de l'épaississement et de la flexion de Brillouin. La résolution subcellulaire du microscope Brillouin permettra aux chercheurs d'étudier plus avant le rôle de ces comportements cellulaires dans la régulation de la biomécanique des tissus. D'autre part, les signaux mécaniques peuvent guider les comportements cellulaires et le destin cellulaire par mécanotransduction au cours du développement embryonnaire36,41 ; ainsi, la technique peut aider à comprendre l'interaction entre la signalisation biochimique et les signaux biomécaniques. De plus, la fermeture du tube neural est physiquement entraînée à la fois par la force générée et la résistance mécanique du tissu10,12,42. La quantification in situ des propriétés mécaniques peut aider à découpler les rôles de la force et de la mécanique tissulaire et ainsi permettre une meilleure élucidation des interactions biomécaniques. De plus, la modélisation informatique est un outil puissant pour comprendre le mécanisme de la morphogenèse43,44,45. Les images mécaniques time-lapse du tissu de la plaque neurale acquises par notre technique peuvent fournir de nouvelles données d'entrée pour la simulation de la neurulation.

Les anomalies du tube neural (ATN) font partie des maladies congénitales humaines les plus courantes et sont régulées par des facteurs génétiques et environnementaux46,47. Au niveau tissulaire, les MTN résultent de la défaillance physique du tube neural due à l'interaction anormale de la génération de force et des propriétés mécaniques du tissu embryonnaire. Des travaux récents suggèrent que l'ATN induite par la mutation génique est associée à une biomécanique tissulaire altérée10. Par conséquent, un outil quantitatif de mesure de la mécanique tissulaire devrait permettre aux chercheurs d'attribuer différentes MTN à une dérégulation spécifique des mécanismes cellulaires qui provoquent l'échec de la fermeture tissulaire, ce qui pourrait combler le fossé entre les facteurs génétiques/environnementaux et la biomécanique tissulaire et contribuer à la prévention de la maladies.

Il est à noter que, par définition, le module longitudinal haute fréquence mesuré par la technique de Brillouin est différent du module d'Young basse fréquence ou quasi-statique mesuré par les méthodes classiques telles que l'AFM. Cependant, pour de nombreux matériaux biologiques, on constate que les deux modules changent dans le même sens en réponse aux activités biologiques48,49. Par conséquent, avec un étalonnage minutieux pour des matériaux spécifiques, on pourrait interpréter les données de Brillouin en termes de module de Young. Dans ce travail, nous avons utilisé le décalage de Brillouin pour estimer le changement relatif du module tissulaire en supposant que le rapport de densité et d'indice de réfraction (\(\rho /{n}^{2}\)) est constant. Pour quantifier directement le module dérivé de Brillouin, la microscopie Brillouin peut être combinée avec d'autres techniques permettant de mesurer la densité et/ou l'indice de réfraction50. À mesure que la profondeur de l'image augmente, la force du signal Brillouin diminue en fonction de la transparence du tissu. Pour les embryons de poulet, la profondeur de pénétration maximale de notre instrument est d'environ 200 µm. Une amélioration supplémentaire peut être obtenue en utilisant une source laser avec une longueur d'onde plus longue ou une technique de correction de front d'onde basée sur l'optique adaptative51. Le décalage de Brillouin inférieur observé à la limite de la plaque neurale sur les Fig. 2 et 3 est probablement un artefact de l'expérience. Dans la configuration confocale, le décalage de Brillouin à chaque pixel est la moyenne de tous les signaux de Brillouin provenant du spot de faisceau focalisé (voxel). A la limite de la plaque neurale, étant donné que la tache du faisceau est partiellement remplie de milieu environnant et/ou de mésoderme qui a un décalage Brillouin inférieur, l'effet de moyenne entraînera une diminution du décalage Brillouin ultime. Cet effet peut être atténué en utilisant une lentille d'objectif à haute NA avec un post-traitement des données35.

Des œufs de Leghorn blancs fécondés ont été achetés à la ferme avicole de l'Université du Connecticut. Pour la culture in ovo, les œufs ont été incubés à 37 ° C sous une humidité élevée. Les heures d'incubation suivent le stade Hamburger-Hamilton (HH) (c'est-à-dire 26 à 29 h d'incubation pour obtenir l'embryon HH-4)52. Toutes les expériences menées dans cette étude étaient conformes aux directives et réglementations pertinentes, et les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le bureau de biosécurité de l'Université du Maryland. Aucun vertébré vivant n'a été utilisé dans cette étude.

Le protocole de culture ex ovo est dérivé de Chapman et al. et Schmitz et al.53,54 avec des modifications pour l'adaptation au microscope Brillouin. Une boîte à fond en verre de 35 mm avec un micropuits de 20 mm (Cellvis, D35-20-0-N) a été utilisée pour la culture ex ovo. Un anneau métallique de 1 pouce (Thorlabs, SM1RR) a été recouvert d'un Parafilm monocouche et un trou d'ellipse de 1 cm a été découpé au centre et placé sur le micro-puits (puits inférieur intérieur du plat). Pour effectuer la culture ex ovo, nous avons utilisé la méthode du support de papier filtre pour maintenir le blastoderme et la membrane vitelline sous tension pour imiter la situation de la culture in ovo. L'embryon pré-cultivé autour de HH 4 a été collecté à partir de l'œuf, puis placé face dorsale vers le bas sur une boîte de culture remplie d'albumine fine récoltée à partir de l'œuf (milieu de culture). Ensuite, la boîte a été placée dans un incubateur sur scène (Warner Instruments, SA-20PLIXR-AL) pour une culture continue. Pour s'assurer que la température ambiante de l'embryon est d'environ 37 °C, le réchauffeur (Warner Instruments, TC-344C) de l'incubateur à l'état allumé a été réglé sur 39 ± 0,2 °C en tenant compte de la dissipation de chaleur par le dessous de la platine qui est ouvert à l'objectif.

La diffusion spontanée de la lumière Brillouin est l'interaction entre la lumière incidente et les phonons acoustiques inhérents à l'intérieur d'un échantillon. Le résultat de cette interaction introduit un décalage de fréquence (décalage de Brillouin) à la lumière diffusée sortante. Le décalage Brillouin \({\omega }_{B}\) est défini comme \({\omega }_{B}=2n/\lambda \cdot \sqrt{{M}^{^{\prime}}/ \rho }\cdot \mathrm{sin}(\theta /2)\), où \(n\) est l'indice de réfraction du matériau, \(\lambda\) est la longueur d'onde du laser, \({M}^{ ^{\prime}}\) est le module longitudinal qui quantifie les propriétés mécaniques, \(\rho\) est la densité et θ est l'angle de collecte de la lumière diffusée. Dans notre microscope Brillouin, la lumière diffusée vers l'arrière a été collectée, donnant \(\theta =180^\circ\).

Pour les matériaux biologiques, une relation empirique entre le module de Young \(E\) et le module longitudinal dérivé de Brillouin \({M}^{^{\prime}}\) a été établie : \(\mathrm{log}\left( {M}^{^{\prime}}\right)=a\cdot \mathrm{log}\left(E\right)+b\), où les paramètres \(a\) et \(b\) sont matériel dépendant24. Considérant la relation entre \({M}^{^{\prime}}\) et le décalage de Brillouin \({\omega }_{B}\), le changement relatif du décalage de Brillouin est lié à celui du module de Young par \ (\Delta E/E=2/a\cdot \Delta {\omega }_{B}/{\omega }_{B}\). Pour les cellules, l'étalonnage par rapport à l'AFM indique \(a=0,0671\). Ici, nous avons utilisé cette relation calibrée pour estimer le changement relatif du module de Young.

Un microscope confocal Brillouin a été utilisé pour toutes les expériences. Le détail de l'instrumentation se trouve dans notre récent rapport25. En bref, un laser à onde continue de 660 nm monomode avec une puissance d'environ 30 mW a été utilisé comme source de lumière. Le faisceau laser a été focalisé dans l'échantillon par une lentille d'objectif (Olympus, 40 × / 0,6 NA) installée sur un microscope inversé (Olympus, IX81), qui donne une taille de spot de 0,7 μm × 0,7 μm × 2,6 μm. Le signal Brillouin rétrodiffusé a été collecté par le même objectif et analysé par un spectromètre VIPA (Light Machinery, 15 GHz FSR) à deux étages, et le spectre Brillouin a été enregistré par une caméra EMCCD (Andor, iXon 897) avec un temps d'exposition de 0,05 s. Les images Brillouin 2D ont été acquises en scannant l'échantillon à l'aide d'une platine motorisée (taille de pas : 0,5 µm). La coupe transversale perpendiculaire à l'axe antéro-postérieur du corps a été cartographiée au microscope Brillouin, et le décalage Brillouin moyen de la région de la plaque neurale a été utilisé pour représenter les propriétés mécaniques du tissu. Le seul contraste d'une image Brillouin provient de la différence de décalage Brillouin des pixels. Le décalage de Brillouin du milieu de culture d'albumine mince est très proche de celui de la plaque neurale pour les embryons à un stade précoce, ce qui rend difficile l'identification de la limite du tissu de la plaque neurale dans l'image de Brillouin. Pour résoudre ce problème, juste avant d'acquérir chaque image Brillouin, l'embryon a été temporairement transféré sur une boîte de culture différente remplie de solution de Ringer (Thermo Scientific, BR0052G) qui a un décalage Brillouin beaucoup plus faible et offre ainsi un bon contraste. Dès que la mesure de Brillouin est effectuée, l'embryon a été retransféré sur un milieu de culture d'albumine mince pour un développement continu. Pour acquérir les images en fond clair, un objectif à faible grossissement (Olympus, 4x/0,1) et une caméra CMOS (Andor Neo) ont été utilisés lorsque l'embryon était dans la boîte de culture ex ovo.

Un programme d'acquisition LabView (National Instruments, ver.2021) construit à la maison a été utilisé pour acquérir à la fois des images en fond clair et les spectres de Brillouin. Pour l'étalonnage du spectromètre, les spectres Brillouin des matériaux (eau et méthanol) avec des décalages Brillouin connus ont été enregistrés et utilisés pour calculer la plage spectrale libre et le rapport de convention pixel à fréquence. Le décalage de Brillouin de chaque pixel a été obtenu en ajustant le spectre de Brillouin à une fonction lorentzienne à l'aide de MATLAB (MathWorks, R2021b). Les images Brillouin 2D ont été reconstruites à partir du vecteur pixel. La taille de l'échantillon a été choisie en fonction de l'expérience antérieure et doit être raisonnablement grande pour démontrer la faisabilité de la technique.

Toutes les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles dans le document et ses fichiers d'informations supplémentaires.

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Nous remercions Eric Frank pour son aide au développement du programme d'acquisition de LabView. Ce travail est soutenu par l'Institut national Eunice Kennedy Shriver de la santé infantile et du développement humain, les Instituts nationaux de la santé (K25HD097288, R01HD095520) et la National Science Foundation (DBI1942003).

Fischell Department of Bioengineering, A. James Clark School of Engineering, Université du Maryland, College Park, MD, 20742, États-Unis

Gestionnaire tchétchène & Giuliano Scarcelli

Département de génie biomédical, Wayne State University, Detroit, MI, 48201, États-Unis

Jitao Zhang

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JZ a conçu le projet. CH, JZ et GS ont conçu le plan de recherche. CH a réalisé les expériences. Tous les auteurs ont discuté des données. JZ et CH ont rédigé le manuscrit avec la contribution de tous les autres auteurs.

Correspondance à Jitao Zhang.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Handler, C., Scarcelli, G. & Zhang, J. Imagerie mécanique accélérée de la fermeture du tube neural dans un embryon vivant à l'aide de la microscopie Brillouin. Sci Rep 13, 263 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-27456-z

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Reçu : 13 octobre 2022

Accepté : 02 janvier 2023

Publié: 06 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-27456-z

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